1. En la placa de cultivo, sumerja los portaobjetos trepados con PBS tres veces durante 3 minutos cada vez.
2. Fije los portaobjetos con paraformaldehído al 4 por ciento durante 15 minutos y sumerja los portaobjetos en PBS 3 veces, 3 minutos cada vez.
3. Permeabilice con 0.5 por ciento Triton X-100 (preparado en PBS) durante 20 minutos a temperatura ambiente (para antígenos expresados en la membrana celular, este paso se omite).
4. Bloqueo de suero: sumerja los portaobjetos en PBS 3 veces durante 3 minutos cada vez, seque el PBS con papel absorbente, agregue suero de cabra normal (siempre que la fuente secundaria de anticuerpos sea de cabra) en los portaobjetos y bloquee a temperatura ambiente durante 30 minutos.
5. Agregue el anticuerpo primario: absorba la solución de bloqueo con papel absorbente, no lave, agregue una cantidad suficiente de anticuerpo primario diluido a cada portaobjetos y colóquelo en una caja húmeda, incube a 4 grados durante la noche.
6. Agregue el anticuerpo secundario fluorescente: sumerja los portaobjetos en PBST 3 veces, 3 minutos cada vez, absorba el exceso de líquido en los portaobjetos con papel absorbente, agregue el anticuerpo secundario fluorescente diluido gota a gota, incube a 20-37 grados durante 1 hora en una caja húmeda, sumerja en PBST Slice 3 veces, 3 min cada vez.
Nota: A partir de la adición del anticuerpo secundario fluorescente, todos los pasos posteriores deben realizarse en un lugar oscuro tanto como sea posible.
7. Bloqueo del suero: seque el líquido con papel absorbente, coloque suero normal de cabra en el portaobjetos de vidrio (siempre que la fuente secundaria de anticuerpos sea de cabra) y bloquee a temperatura ambiente durante 30 minutos.
8. Agregue el anticuerpo primario: absorba la solución de bloqueo con papel absorbente, no lave, luego agregue el anticuerpo primario diluido gota a gota e incube durante la noche en una caja húmeda de 4 grados en la oscuridad después de agregar el anticuerpo primario. (Nota: la especie del segundo anticuerpo primario es diferente de la especie del primer anticuerpo primario, como el ratón y el conejo)
9. Agregue el anticuerpo secundario fluorescente: sumerja los portaobjetos en PBST 3 veces, 3 minutos cada vez, absorba el exceso de líquido en los portaobjetos con papel absorbente, agregue el anticuerpo secundario fluorescente diluido gota a gota, incube a 20-37 grados durante 1 hora en una caja húmeda, sumerja en PBST Slice 3 veces, 3 min cada vez. (Nota: Si se selecciona la fluorescencia roja para la detección del primer anticuerpo, el segundo debe seleccionar otros colores de fluorescencia)
10. Núcleos de contratinción: se añadió gota a gota DAPI y se incubó en la oscuridad durante 5 minutos, se tiñeron las muestras y se lavó el exceso de DAPI con PBST 5 min x 4 veces.
11. Seque el líquido del portaobjetos con papel absorbente, selle el portaobjetos con un líquido de montaje que contenga un extintor antifluorescencia y observe y recopile imágenes bajo un microscopio de fluorescencia.
