La tecnología PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN y su especificidad se basa en cebadores de oligonucleótidos complementarios a ambos extremos de la secuencia objetivo. La PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización, hibridación y extensión. Este proceso de reacción se lleva a cabo en el recipiente de reacción de PCR. Con el desarrollo continuo del instrumento de amplificación de genes, el recipiente de reacción también ha experimentado el desarrollo gradual del tubo de centrífuga de 1,5 ml a 0,2 ml (0,25 ml) al {{ 7}}.2ml dedicado para PCR. , 0tubo de 0,1 ml pcr. Con el aumento en el número de reacciones de amplificación por PCR, se forman gradualmente contenedores de amplificación de genes de alto rendimiento para tiras y placas de PCR.
La PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización-recocido-extensión
Desnaturalización del ADN molde:
Después de que la plantilla de ADN se calienta a aproximadamente 94 grados durante un cierto período de tiempo, el ADN de doble cadena de la plantilla de ADN o el ADN de doble cadena formado por amplificación por PCR se disocia, de modo que se puede combinar con el cebador para preparar para la siguiente ronda de reacción.
Recocido (renaturalización) del ADN molde con cebadores:
Después de que la plantilla de ADN se desnaturalice en una sola hebra por calentamiento, y la temperatura se reduzca a aproximadamente 55 grados, los cebadores se emparejan con la secuencia complementaria de la cadena única de la plantilla de ADN.
Extensión de cebadores:
Bajo la acción de Taq, el conjugado cebador-molde de ADN utiliza dNTP como materia prima de reacción para sintetizar una nueva cadena de replicación semi-reservada complementaria a la cadena de ADN molde según el principio de apareamiento de bases y replicación semi-reservada.
Principios básicos de la tecnología PCR
La tecnología se basa en una reacción de síntesis enzimática de ADN polimerasa en presencia de ADN molde, cebadores y cuatro desoxirribonucleótidos.
La ADN polimerasa utiliza ADN monocatenario como plantilla para iniciar la síntesis con una pequeña porción de ADN bicatenario. Uno o dos cebadores de oligonucleótidos sintéticos se combinan con una secuencia complementaria en la plantilla de ADN monocatenario para formar un ADN parcial de doble cadena.
Bajo una temperatura y un entorno adecuados, la ADN polimerasa agrega desoximononucleótido al extremo 3´-OH del cebador y lo usa como punto de partida para extenderse a lo largo de la dirección 5´→3´ de la plantilla para sintetizar una nueva cadena complementaria de ADN.
La diferencia entre los tubos de PCR y los tubos de centrífuga
Tubos PCR:
La placa de reacción de PCR es 96-bien o 384-bien, que está especialmente diseñada para reacciones por lotes. El principio es que el rendimiento de la máquina PCR y el secuenciador es generalmente 96 o 384.
Tubo centrífugo:
El tubo de centrífuga no es necesariamente un tubo de PCR. Hay muchos tipos de tubos de centrífuga según su capacidad. Los más utilizados son de 1,5 ml, 2 ml, 5 ml, 15 o 50 ml, y el más pequeño (250 ul) se puede utilizar como tubo de PCR.
Cómo elegir los tubos de PCR
Elegimos colocar los tubos de PCR con la esperanza de elegir la ubicación más precisa para la temperatura.
La posición más precisa de la temperatura debe ser la posición sobre el sensor de temperatura debajo del módulo (independientemente de la temperatura imprecisa del sensor).
La posición del sensor de temperatura de diferentes instrumentos de PCR es diferente.
Por ejemplo, el 2720 de AB tiene solo uno en el medio, el 200 de MJ tiene tres sensores, que están en la parte inferior izquierda, en el medio y en la parte superior derecha, el de Eppendorf debe estar en la fila A o H, y el Dongshenglong 811 tiene tres sensores de temperatura, B{{3} } debe seleccionarse , C1-2, C6-7, D6-7, B11-12, C11-12, porque estos puntos son puntos puntuales de temperatura.