La tecnología de PCR debe haber sintetizado artificialmente cebadores razonables y extraído el ADN de la muestra, y luego realizar ciclos térmicos automáticos y, finalmente, realizar la identificación y el análisis del producto. En la actualidad, el diseño y la síntesis de imprimaciones solo se pueden llevar a cabo en unos pocos institutos de investigación, institutos y clínicas con una gran capacidad técnica. La aplicación solo necesita comprar el kit de detección de PCR para comenzar el trabajo. Hay muchos factores que influyen en el ciclo térmico automático de PCR. Para diferentes muestras de ADN, la cantidad de varios componentes añadidos en la reacción de PCR y los parámetros del ciclo de temperatura son inconsistentes.
A continuación se presentan varios factores de influencia principales.
Uno, parámetros del ciclo de temperatura
En el ciclo térmico automático de PCR, el factor más crítico es la temperatura de desnaturalización y recocido. Como se muestra en el ejemplo de operación, las condiciones de desnaturalización, recocido y extensión son: 94 ℃ 60 s, 37 ℃ 60 s, 72 ℃ 120 s, un total de 25 ～ 30 A ciclo, el fragmento amplificado es 500 pb. Aquí, el tiempo de cada paso debe calcularse después de que la mezcla de reacción alcance la temperatura requerida. En el termociclador automático, el tiempo desde la temperatura original de la mezcla hasta la temperatura requerida toma entre 30 y 60 segundos.La duración de este tiempo de retardo depende de varios factores, incluido el tipo de tubo de reacción, el grosor de la pared, el volumen de la mezcla de reacción, el calor. fuente (baño de agua o bloque calefactor), y la diferencia de temperatura entre los dos pasos, que debe proporcionarse adecuadamente al configurar el ciclo térmico Preste atención y considere, y la medición real debe realizarse en cada instrumento.
Otra consideración importante sobre el tiempo del ciclo térmico es la distancia entre los dos cebadores; cuanto mayor es la distancia, más se tarda en sintetizar la longitud completa de la secuencia objetivo. El tiempo de reacción indicado anteriormente se basa en la longitud de síntesis óptima de 500 pb. Se elabora la secuencia diana. Aquí hay una introducción a la selección de varias temperaturas.
1. Temperatura de desnaturalización de la plantilla La temperatura de desnaturalización determina la temperatura a la que el ADN bicatenario se funde en la reacción de PCR. Si no se alcanza la temperatura de desnaturalización, no se producirá ninguna plantilla de ADN monocatenario y no se iniciará la PCR. Baja temperatura de desnaturalización significa desnaturalización incompleta, ADN de doble hebra Renaturalizará rápidamente, reduciendo así el rendimiento. Generalmente 90 ～ 95 ℃. Una vez que la muestra alcanza esta temperatura, debe enfriarse rápidamente a la temperatura de recocido. La desnaturalización del ADN solo lleva unos segundos y no es necesaria durante mucho tiempo; por el contrario, debe esforzarse al máximo a altas temperaturas. Acórtelo para mantener la actividad de la ADN polimerasa Taq. La temperatura máxima de desnaturalización después de agregar la ADN polimerasa Taq no debe exceder los 95 ° C.
2. Temperatura de recocido del cebador La temperatura de recocido determina la especificidad y el rendimiento de la PCR; si la temperatura es alta, la especificidad es fuerte, pero si la temperatura es demasiado alta, el cebador no se puede combinar firmemente con la plantilla y se reduce la eficiencia de amplificación del ADN; la temperatura es baja, el rendimiento es alto, pero demasiado bajo puede causar un desajuste entre el cebador y el molde. Los productos no específicos aumentan. Generalmente, comience con la condición de reacción de 37 ℃, configure una serie de reacciones de control para determinar la temperatura de recocido óptima para una reacción específica. También se puede inferir en función del contenido de (G + C)% de las imprimaciones para comprender la prueba. El punto de partida de la prueba general, la temperatura de recocido Ta (temperatura de recocido) es 5 ℃ más baja que la temperatura de fusión TTm (temperatura de fusión) del cebador de amplificación, que se puede calcular de acuerdo con la fórmula:
Ta = Tm-5 ℃ = 4 (G {{2}} C) {{4}} 2 (A+T) -5 ℃
Entre ellos, A, T, G y C, respectivamente, representan el número de bases correspondientes. Por ejemplo, para un cebador de 20 bases, si el contenido de (G + C)% es 50%, el punto de partida de Ta se puede establecer en 55 ° C. A una concentración de imprimación típica (como 0,2 μmol / L), la reacción de recocido se puede completar en unos pocos segundos y no es necesario el recocido a largo plazo.
3. La elección de la temperatura de extensión del cebador depende de la temperatura óptima de la ADN polimerasa Taq. Generalmente 70 ～ 75 ℃, la tasa estándar de nucleótidos catalizados por enzimas a 72 ℃ puede alcanzar 35 ～ 100 nucleótidos / seg. por minuto. La longitud de 1 kb se puede extender y su velocidad depende de la composición de la solución tampón, el valor del pH, la concentración de sal y la naturaleza de la plantilla de ADN. Si el fragmento amplificado tiene menos de 150 pb, se puede omitir el paso de extensión y se convierte en un ciclo de temperatura dual, debido al ADN Taq. La polimerasa es suficiente para completar la síntesis de secuencias cortas a la temperatura de hibridación. Para fragmentos de secuencia corta entre 100 y 300 pb, es eficaz utilizar un ciclo de temperatura dual rápido y simple. En este momento, la temperatura de extensión del cebador es la misma que la temperatura de recocido. Para fragmentos de ADN por encima de 1 kb, el tiempo de extensión se puede controlar entre 1 y 7 minutos según la longitud del fragmento. Al mismo tiempo, se debe agregar gelatina o reactivo BSA al tampón de PCR para mantener la ADN polimerasa Taq activa y estable durante mucho tiempo. Sexo; El 15% -20% de glicerol ayuda a amplificar fragmentos de ADN de aproximadamente 2,5 kb o más.
4. El número de ciclos de la PCR convencional es generalmente de 25 a 40 ciclos. El error general es que el número de ciclos es demasiado, el fondo no específico es grave y la complejidad aumenta. Por supuesto, el número de ciclos de la reacción es demasiado pequeño y el rendimiento es bajo. Por tanto, es necesario asegurarse de que se obtenga el producto. Bajo la premisa de la tasa, el número de ciclos debe minimizarse.
Una vez completada la amplificación, la muestra se enfría y se almacena a 4 ° C.
2. Primer diseño de imprimación
Para amplificar la plantilla de ADN, primero debe diseñar dos cebadores de oligonucleótidos. Los denominados cebadores son en realidad dos fragmentos de oligonucleótidos que son complementarios a la secuencia de ADN diana que se va a amplificar. La distancia entre los dos cebadores determina la longitud del fragmento amplificado. , Los extremos 5' de los dos cebadores determinan las posiciones de los dos extremos 5' del producto amplificado. Puede verse que los cebadores son la clave para determinar la longitud, la posición y los resultados de los fragmentos amplificados por PCR, y el diseño del cebador es más importante.
La condición necesaria para el diseño del cebador es que se debe conocer la secuencia de ADN diana complementaria al cebador. La secuencia entre los dos cebadores no es necesariamente clara. Las dos secuencias conocidas son generalmente de 15 a 20 bases, que se pueden sintetizar con un sintetizador de ADN. Además, en correspondencia con dos cebadores complementarios, los principios que se siguen generalmente en el diseño de cebadores incluyen:
1. La longitud del cebador se calcula según las estadísticas, y la probabilidad de que aparezca una secuencia de oligonucleótidos de aproximadamente 17 bases en el genoma humano es una vez. Por lo tanto, la longitud del cebador generalmente no es menor de 16 nucleótidos y la más alta es de No más de 30 nucleótidos y la mejor longitud es de 20-24 nucleótidos. Tales oligonucleótidos cortos no formarán un híbrido estable a la temperatura de polimerización (pasando de 72 ° C). A veces puede ser a las 5' Agregue secuencias que no sean complementarias al molde al final, como sitios de enzimas de restricción o promotores, para completar la clonación de genes y otras necesidades especiales; el cebador 5' etiqueta de biotina final o etiqueta fluorescente se puede utilizar para diversos fines, como la detección microbiana.
A veces, el cebador no funciona, se desconoce el motivo, puede mover la posición para resolverlo.
2. La composición de los imprimadores con contenido de (G + C)% debe ser uniforme y tratar de evitar que contengan el mismo polímero base. El contenido de (G + C)% en los dos cebadores debe ser lo más similar posible, en el fragmento conocido amplificado (G + C)% El contenido debe estar cerca del fragmento que se va a amplificar, generalmente 40% a 60% es mejor.
3. El interior de la imprimación debe evitar la formación de estructuras secundarias obvias, especialmente estructuras en horquilla. Por ejemplo:
4. No debe haber complementación entre los dos cebadores entre los cebadores, especialmente en el extremo 3' del cebador. Incluso si no se puede evitar, la base complementaria del extremo 3' no debe ser mayor de 2 bases, de lo contrario es fácil formar un dímero de cebador"" O" Dímero de cebador" (Primer dímero). El denominado dímero de cebador es esencialmente un fragmento de ADN de doble hebra formado por extensión de un cebador sobre la otra secuencia de cebador bajo la acción de la ADN polimerasa. , Es un subproducto común de la PCR y, a veces, incluso se convierte en el producto principal.
Además, evite las secuencias homólogas entre los dos cebadores, especialmente los fragmentos de oligonucleótidos con más de 6 bases idénticas consecutivas, de lo contrario los dos cebadores competirán entre sí por el mismo sitio del molde; de manera similar, los cebadores y el ADN diana a amplificar u otras secuencias del ADN de la muestra no pueden tener secuencias homólogas de más de 6 bases. De lo contrario, los cebadores se unirán a otros sitios, reduciendo la amplificación específica y aumentando la amplificación inespecífica.
5. Primer 3' el emparejamiento final de la ADN polimerasa agrega un solo nucleótido al extremo 3' del cebador. Por lo tanto, los requisitos de emparejamiento de 5-6 bases del extremo 3' del cebador y el ADN diana deben ser precisos y estrictos para garantizar una amplificación por PCR eficaz. .
Si el diseño del cebador es razonable se puede verificar mediante una búsqueda por computadora utilizando el software PCRDESN y el software American PRIMER.
Los oligonucleótidos sintetizados artificialmente deben purificarse preferiblemente mediante cromatografía (cromatografía) o PAGE para eliminar impurezas tales como cadenas cortas que no se han sintetizado en toda su longitud. Los primers purificados almacenados en una solución de acetonitrilo al 25% a 4 ° C pueden prevenir la aparición de microorganismos En circunstancias normales, los primers no utilizados deben almacenarse en un refrigerador a -20 ° C. Las imprimaciones se pueden almacenar en líquido durante 6 meses y se pueden almacenar de 1 a 2 años después de la liofilización.