¿Qué es el cultivo celular?
cultivo de células
El cultivo celular se refiere al proceso de crecimiento de células en condiciones controladas fuera de su entorno natural. Es una herramienta in vitro que facilita la comprensión de la biología celular y los mecanismos de la enfermedad. También desempeña un papel en el descubrimiento de fármacos, como las pruebas de toxicidad de fármacos y los estudios farmacocinéticos/farmacodinámicos, así como en la medicina personalizada.
El embriólogo estadounidense Ross Granville Harrison desarrolló las primeras técnicas de cultivo celular in vitro a principios del siglo XX, cuando cultivó con éxito fragmentos de tejido de embriones de rana in vitro. Hoy en día, el cultivo celular ha ayudado a innumerables descubrimientos, como el desarrollo de vacunas contra la poliomielitis, el sarampión, las paperas y otras enfermedades infecciosas.
Cultura de Adhesión y Suspensión
Existen dos sistemas básicos para el crecimiento celular: cultivo adherente y cultivo en suspensión. Los cultivos adherentes se cultivan en sustratos artificiales, mientras que las células en cultivos en suspensión flotan libremente en el medio. Mientras que solo unos pocos tipos de células crecen de forma natural en suspensión (p. ej., linfocitos), muchos tipos de células adherentes se pueden adaptar al cultivo en suspensión.
Hay dos razones para cultivar células naturalmente adherentes en suspensión. La primera ventaja del cultivo en suspensión es que las células son más fáciles de pasar porque no es necesario disociarlas enzimática o mecánicamente del recipiente de cultivo. En segundo lugar, los cultivos en suspensión son más fáciles de ampliar porque el crecimiento celular está limitado solo por su concentración en el medio, no por el área de superficie disponible. La principal desventaja de los cultivos en suspensión es que requieren recuentos celulares diarios y ensayos de viabilidad para seguir los patrones de crecimiento, mientras que los cultivos adherentes se pueden examinar fácilmente bajo un microscopio.
Métodos 2D y 3D
Los cultivos adherentes se pueden dividir en cultivos 2D y 3D. En las aplicaciones 2D, las células adherentes se cultivan en un sistema de monocapa sobre una superficie plana, como en un matraz de cultivo celular.
cultivo de células
Debido a su simplicidad, la tecnología 2D no puede imitar el entorno in vivo de las células, que normalmente crecen en estructuras tridimensionales con interacciones complejas de célula a célula. Esta es la razón por la que algunos experimentos se realizan utilizando cultivos 3D que se pueden cultivar utilizando tecnologías basadas en andamios o sin andamios.
Los métodos 3D basados en andamios suelen implicar el cultivo de células adherentes en andamios de hidrogel. Alternativas como andamios de biocerámica, metal o polímero también se utilizan para algunas aplicaciones.
Las técnicas sin andamios se utilizan para cultivar esferoides mediante uno de tres métodos diferentes:
Flotación forzada: cargue la suspensión celular en los pocillos de una microplaca recubierta de polímero de baja adherencia. A continuación, la microplaca se centrifuga para obligar a las células a formar esferoides.
Gota colgante: la suspensión celular se carga en los pocillos de una placa de gota colgante. Como sugiere el nombre, la suspensión se colgará en el plato en forma de gotas. Las células se agregarán en las puntas de estas gotitas y formarán esferas.
Basado en agitación: la suspensión celular se coloca en un biorreactor rotatorio. Debido a la constante agitación, las células no pudieron adherirse a las paredes, formando así esferoides.
Desafío de cultivo celular
A pesar de las diferencias en métodos y técnicas, todos los experimentos tienen una cosa en común: es difícil cultivar células vivas en el número necesario para obtener resultados reproducibles. Por lo tanto, las siguientes secciones se dedicarán a cuatro desafíos: repetibilidad, contaminación, viabilidad y la transición a la automatización.
reproducibilidad
Según una encuesta realizada por Yongyue Medical, más del 70 por ciento de los científicos informaron que no pudieron reproducir los experimentos de otro científico y más de la mitad no pudieron reproducir su propio trabajo. En los ensayos de cultivos celulares, la mayoría de los problemas de reproducibilidad surgen de las diferencias biológicas entre pases o generaciones celulares. Otro gran problema es la identificación errónea de líneas celulares, y las inconsistencias en los parámetros de cultivo también juegan un papel importante.
variación biológica
Factores como mutaciones aleatorias o errores de transcripción tienen el potencial de afectar la reproducibilidad de los experimentos cada vez que una célula se divide. Para evitar esto, debe crear un banco de células al comienzo de un nuevo proyecto.
banco celular
El banco de células se refiere al proceso de almacenamiento de lotes de tipos de células específicos para su uso posterior para evitar factores como mutaciones aleatorias o errores de transcripción que afectan la reproducibilidad. El primer paso es establecer un banco de células maestras (MBC) mediante el cultivo de tipos de células seleccionadas de interés en cultivo y su crioconservación en varios contenedores. Los lotes de MBC se descongelan y se utilizan más tarde para preparar bancos de células de trabajo (WBC).
Identificación errónea de líneas celulares
El problema de la identificación errónea de líneas celulares se conoce desde la década de 1960, cuando un científico describió la contaminación con células HeLa de otras 19 líneas celulares humanas. Para asegurarse de que sus resultados sean fiables y, lo que es más importante, de que no saque conclusiones falsas, debe poner en cuarentena todas las líneas celulares nuevas que entren en el laboratorio hasta que se haya verificado su origen. Lo que es más importante, se recomienda repetir la calificación de la línea celular antes de la criopreservación y distribución a otros laboratorios y después de que se complete el proyecto. Para verificar una línea celular, primero debe verificar si está incluida en el registro de líneas celulares mal identificadas. Si no está registrado, aún debe confirmar su autenticidad. Para las líneas celulares humanas, se recomienda el análisis de repetición corta en tándem (STR) (huellas dactilares de ADN). Hay una variedad de métodos de prueba disponibles para líneas celulares no humanas, que incluyen cariotipado, análisis de isoenzimas y tipificación de ADN mitocondrial (código de barras de ADN).
Parámetros de cultivo
Un tercer factor que afecta la reproducibilidad son los parámetros de cultivo.
Por ejemplo, los niveles de oxígeno pueden afectar significativamente a las células cultivadas. Sin embargo, las variables que afectan la oxigenación, como el tamaño de la cámara o la densidad celular, no siempre se documentan y, por lo tanto, no se pueden mantener constantes.
Otro parámetro de cultivo importante es el medio. Esto proporciona nutrientes esenciales, factores de crecimiento y hormonas, y regula el pH y la presión osmótica. Por eso, lo más importante es que su composición sea siempre la misma. Esto es especialmente crítico para las formulaciones medianas suplementadas con suero fetal bovino (FBS), cuya composición depende de factores como la dieta de la vaca, la ubicación geográfica y la época del año. Para minimizar el efecto de FBS en la reproducibilidad de los resultados, debe pedir diferentes lotes de suero cuando las existencias actuales comiencen a agotarse y probarlos para encontrar la coincidencia más cercana. Para que otros puedan reproducir sus resultados, debe informar cómo analizó el suero y registrar el número de lote.
cultivo de células
Procesamiento celular
La mayoría de los investigadores saben que los parámetros de cultivo tienen un gran impacto en sus aplicaciones, pero a menudo se pasan por alto los cambios en las técnicas de procesamiento.
Contaminación
Cuando las células se aíslan del tejido y se cultivan en el laboratorio, ya no están protegidas por el sistema inmunitario y, por lo tanto, son extremadamente vulnerables a la contaminación.
La primera fuente de contaminación son los contaminantes abióticos, como las impurezas en el medio de cultivo, el suero, los suplementos o el agua, así como las endotoxinas y los lixiviables. Las precauciones incluyen el uso de agua de laboratorio para experimentos de cultivo celular y medios, suero, suplementos y consumibles de fabricantes que ofrecen certificación de pruebas de endotoxinas. Además, los consumibles deben estar hechos de poliestireno virgen o polipropileno para garantizar que los aditivos plásticos no se filtren en su cultivo celular.
La segunda fuente de contaminación son los contaminantes biológicos como las bacterias (incluido el micoplasma), los hongos y las levaduras.
factibilidad
La viabilidad celular se define como la proporción de células viables en una muestra. Además de los contaminantes que acabamos de ver, existen otros factores que afectan la viabilidad celular. Las condiciones ambientales (temperatura, pH, presión osmótica, disponibilidad de nutrientes y concentraciones de O2 y CO2) son muy importantes. La mayoría de estas variables están controladas por el medio y son específicas del tipo de célula, lo que lamentablemente significa que no podemos proporcionar pautas específicas.
Dado que las celdas son muy sensibles a la presión, debe prestar atención no solo a las condiciones ambientales, sino también a sus técnicas de manejo de líquidos.
Un factor final que afecta la viabilidad celular es la senescencia. La mayoría de las líneas celulares finitas sobreviven de 20 a 60 divisiones antes de morir, lo que significa que solo pueden reutilizarse entre 15 y 45 generaciones. Posteriormente, la muestra crioconservada debe descongelarse del banco de células. Las líneas celulares continuas pueden proliferar indefinidamente, pero debido a que son propensas a la deriva genética, deben reemplazarse con regularidad.
Los ensayos de detección que utilizan métodos colorimétricos, fluorométricos y bioluminiscentes se pueden utilizar para medir la viabilidad celular. Un método colorimétrico de uso común es el método MTT, que se basa en la reducción de sales amarillas de tetrazolio a cristales de formazán púrpura por células vivas.
96-placas de pocillos
automatización
Muchos de los desafíos descritos anteriormente se pueden abordar mediante la automatización de los flujos de trabajo de cultivo celular. Por ejemplo, el manejo de las células siempre será uniforme, lo que tendrá un impacto positivo en la reproducibilidad y la viabilidad. Lo que es más importante, la automatización reduce el riesgo de contaminación del usuario.
A pesar de estas ventajas, la automatización de flujos de trabajo completos puede ser un desafío debido a razones de presupuesto, falta de espacio para robots o porque no hay suficientes recursos para automatizar y validar cada paso a la vez. ¡Pero esto se puede solucionar!