Hoy, hablemos de un elemento clave en los experimentos de PCR: los consumibles. Como visitante frecuente de PCR, es necesario comprender las características y la terminología relacionada con los consumibles de PCR.
Hay una gran variedad de consumibles para PCR en el mercado, incluyendo marcas, especificaciones, colores, etc., que son deslumbrantes. Entendámoslo paso a paso.
placa pcr
1. Materiales
Por lo general, la materia prima de los consumibles de PCR es el polipropileno. Es un buen material inerte resistente al calor. El rango de temperatura de trabajo es de -30 a 140 grados, lo que le permite resistir los cambios de energía térmica durante el ciclo térmico de la reacción de PCR y juega un buen papel en el sellado y la protección de las sustancias en el sistema de reacción de PCR.
Más información sobre el polipropileno
2. Color
Los más comunes son los tubos blancos y los tubos PCR transparentes. En los experimentos de PCR tradicionales, no hay diferencia entre los dos. Sin embargo, en el mismo experimento en tiempo real/qPCR, los tubos blancos fueron relativamente más sensibles y consistentes para los instrumentos de qPCR con lecturas de señales apicales (consulte las Figuras A y B a continuación). ¿Por qué es como este?
tubo pcr
A: valores de Ct más bajos para los tubos blancos en comparación con los tubos transparentes; B: mejor repetibilidad con tubos blancos.
Los datos principales de la qPCR son el valor de Ct y la señal de fluorescencia es la fuente de datos para calcular el valor de Ct, por lo que es muy importante que la fluorescencia del tubo pueda transmitirse por completo al detector. La pared blanca del tubo evita que la fluorescencia pase a través de la pared del tubo y se refracte (Figura A a continuación), evitando así que la fluorescencia se transmita al bloque de calentamiento (es decir, la pared del orificio de metal donde se coloca el tubo) y se absorba o reflejados de manera inconsistente por el bloque. Se recolectó una señal fluorescente más fuerte y más concentrada en la punta del tubo blanco en comparación con el tubo transparente (Figura B a continuación).
tubo pcr
A: La tendencia cambiante de la señal de fluorescencia en el tubo transparente y el tubo blanco; B: La comparación de la intensidad de la fluorescencia después de agregar la misma cantidad de fluoresceína.
Entonces, si está utilizando un instrumento qPCR de lectura superior, pruebe con tubos blancos.
3. Calidad (Lean o No Lean)
Aquí se enfatiza la importancia de la calidad de los consumibles. Los consumibles de qPCR deben estar libres de contaminantes e inhibidores. La alta presión y la radiación eliminan las bacterias y las ADNasas, pero no el polvo ni los residuos de ADN, que pueden inhibir las reacciones de PCR o producir una amplificación no específica. Las sustancias tienen absorbancia, e incluso los contaminantes más pequeños absorberán la fluorescencia en el sistema de reacción y afectarán la recopilación de señales de fluorescencia. Se utilizó una versión exagerada del experimento para demostrar el efecto de la contaminación por impurezas en el experimento. Como se muestra en la figura a continuación, se colocó una impureza en uno de los pozos de reacción de la octava. Como era de esperar, las curvas de amplificación mostraron marcadas anomalías.
Impurezas en los tubos de reacción de PCR
↑ Impurezas en el tubo de reacción
8 tiras
↑ Resultados de reacción repetidos para 8 tubos, la impureza del pozo izquierdo "desvía" la curva.
Recordatorio: tenga cuidado de no exponer los consumibles al aire durante mucho tiempo. Después de sacar los consumibles, asegúrese de sellar la bolsa de embalaje rápidamente para evitar tocarla con las manos desnudas. Si es posible, trabaje en un banco limpio.
4. Capacidad / Tamaño / Flujo
El volumen determina la cantidad de muestra (volumen de reacción) que se puede cargar. La sobredosis puede resultar en una menor eficiencia de transferencia de calor, derrames o contaminación cruzada; la infradosificación puede provocar la pérdida de la muestra por evaporación. El bloque de calentamiento del instrumento qPCR también determinará los consumibles aplicables y el tamaño del sistema de reacción aplicable. El rendimiento es fácil de entender, es el número máximo de muestras que se pueden cargar en un solo experimento. Las especificaciones comunes de capacidad y flujo se muestran en la siguiente tabla:
Tubo único/ocho filas {{0}}.2mL, 0.1mL
{{0}}placa de pozo 0.2mL, 0.1mL
{{0}}placa de pocillos de 0,2 ml
Las especificaciones de capacidad también se dividen generalmente en tipos estándar y bajo, como se muestra a continuación. Los consumibles de bajo perfil tienen una altura más baja. Este diseño corto minimiza el espacio sobre el sistema de reacción ("volumen muerto" - la parte inútil), reduce los efectos de la evaporación durante el ciclo térmico y permite que el módulo de calentamiento lo envuelva en mayor medida para mejorar la eficiencia de transferencia de calor. Por lo tanto, los tubos de perfil bajo también se conocen como tubos o placas "rápidos".
tubo pcr
Recordatorio: El volumen de reacción comúnmente utilizado es de 20 µL y se recomienda utilizar un tubo de reacción de volumen pequeño de 0,1 mL o un volumen pequeño.
5. Espesor de pared
El espesor de la pared del tubo afecta directamente la conductividad térmica. Los consumibles de PCR deben tener un grosor de pared uniforme para proporcionar una transferencia de calor uniforme. La pared del tubo ultrafino es un 50 por ciento más delgada que la versión estándar, lo que reduce aún más la barrera térmica y brinda efectos de respuesta mejores y más rápidos. Por lo tanto, para maximizar la eficiencia de las reacciones de PCR y garantizar reacciones estables y eficientes, los consumibles de PCR uniformes y ultradelgados son la mejor opción.
6. Transparencia
Las tapas y las películas de sellado para qPCR requieren una alta claridad óptica para garantizar una penetración y transmisión óptimas de las señales fluorescentes al tiempo que se reduce la distorsión (para los instrumentos de qPCR de lectura superior). Cuanto mayor sea la transparencia de la pared del tubo, puede afectar los resultados experimentales. La razón se ha explicado anteriormente. La PCR tradicional puede ignorar esta función.
7. Faldas
El faldón de una placa PCR se refiere a la extensión periférica de la placa. Cuando se construyen sistemas de reacción, la falda actúa como un soporte estable para los procesos de pipeteo y proporciona resistencia mecánica y agarre cuando se combina con estaciones de trabajo automatizadas. Hay tres tipos comunes de faldas, medias faldas y faldas completas (correspondientes a A, B y C en la figura a continuación).
Sin falda: se puede usar con la mayoría de los instrumentos de PCR o qPCR, pero no para aplicaciones automatizadas. Fácil de mover durante el pipeteo, no muy estable, debe usarse con un soporte para placas.
Medias faldas: ideales para aplicaciones automatizadas con buena estabilidad de pipeteo.
Placa de falda completa: ideal para aplicaciones automatizadas. Buena resistencia mecánica, adecuado para instrumentos de PCR con módulos sobresalientes, alta estabilidad durante el pipeteo.
placa pcr
Consejos: la importancia de la falda es más para facilitar la industrialización y el procesamiento por lotes automatizado, combinado con el brazo robótico. Puede que no sea necesario en los laboratorios de investigación tradicionales, ninguna falda es suficiente.
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8. Parafilm
La película de sellado de la placa PCR está hecha de plástico transparente o papel de aluminio. Las películas adhesivas transparentes son más comunes, adecuadas para placas de 96 o 384 pocillos, y deberían tener una transmisión de luz suficientemente buena. Al sellar la película, se utilizará una tarjeta pequeña para presionar la película alrededor del orificio de sellado para evitar fugas de aire.
Las películas adhesivas de aluminio pueden ser menos comunes. Aunque no es adecuado para qPCR, es el consumible ideal para muestras sensibles a la luz. Debido a que se puede perforar, facilita la transferencia de muestras en PCR (para PCR convencional).
Película de sellado de placas PCR
Resumir
Como portador del sistema PCR, los consumibles son muy importantes para mejorar la calidad de los datos experimentales. Espero que este intercambio pueda ayudarlo a comprender algunos consejos sobre los consumibles de PCR y brindarle ayuda para una mejor selección de consumibles.