1. Recuperación
●1. Saque el criovial del nitrógeno líquido, colóquelo inmediatamente en un baño de agua a 37 grados y agítelo ligeramente. Después de que el líquido se haya derretido (alrededor de 1-1.5 minutos), sáquelo y rocíe un poco de alcohol y colóquelo en el banco de trabajo ultralimpio.
●2. Aspire la suspensión de células anterior en un tubo de centrífuga de 15 ml lleno con 10 ml de medio (lave el tubo de crioconservación con medio para lavar todas las células adheridas a la pared) y centrifugue a 1000 rpm durante 5 minutos.
●3. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de medio para suspender las células. Aspirado en una placa de Petri de 10 cm que contiene 10 ml de medio de cultivo y agitado suavemente de un lado a otro para que las células en la placa de Petri se distribuyan uniformemente.
●4. Etiquete el tipo de celda y la fecha, el nombre del cultivador, etc., y colóquelo en una incubadora de CO2 para el cultivo. Después de que las células se adhieran a la pared, cambie el medio.
●5. Cambie el medio cada 3 días.
2. Pasaje
●1. Paso cuando la cobertura celular en la placa de cultivo alcanza el 80 por ciento -90 por ciento.
●2. Aspirar el medio original.
●3. Agregue la tripsina adecuada (solo la suficiente para cubrir las células) y digiera durante 1-2 minutos.
●4. Después de redondear las células, agregue un volumen igual de medio que contenga suero para terminar la digestión.
●5. Use una pipeta para suspender las células pipeteando.
●6. Aspire las células en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugue a 1000 rpm durante 5 minutos.
●7. Retire el sobrenadante, agregue 1-2ml de medio y explote las células.
●8. Transfiera las células a varios platos según el tipo de célula. Generalmente, hay 5 células cancerosas y 3 células normales. Continúe cultivando.
3. Criopreservación Digerir las células y centrifugar (ibíd.). Suspenda las células con la solución de congelación preparada y distribúyalas en crioviales esterilizados, déjelos reposar unos minutos e indique el tipo de célula y la fecha de criopreservación. 4 grados durante 30 minutos, -20 grados durante 30 minutos, -80 grados durante la noche y luego se colocan en nitrógeno líquido para su almacenamiento. Preparación de la solución de crioconservación: 70 por ciento de medio completo más 20 por ciento de FBS más 10 por ciento de DMSO. El DMSO debe agregarse gota a gota lentamente, agitando mientras gotea.
